BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar belakang
Plasmid
adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif
kecil di luar kromosom yang terdapat
di dalam sel prokariot, khususnya bakteri
dan sel eukariotik tingkat rendah . DNA plasmid
berukuran lebih kecil dari DNA kromosom dan dapat bereplikasi sendiri. Plasmid
biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E.
coli sebagai host, sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering
digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang.
Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan
produk komersial tertentu seperti insulin,
interferon, dan berbagai enzim (Stanfield 1996). Penggunaan plasmid
dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang
berperan penting untuk DNA kloning, yaitu, replication origin, marker
yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen
resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi
oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al).
Elektroforesis
DNA merupakan teknik untuk memisahkan
sampel DNA berdasarkan ukuran (berat
molekul) dan struktur fisik molekulnya. Posisi molekul
yang terpisah pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,
ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk
makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi
karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan
agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk pemisahan protein
dan asam nukleat (DNA). Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi
yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya.
Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul
berdasarkan muatannya. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan
listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif . Makin besar
ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat
molekul suatu fragmen DNA dapat
diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi
fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah
diketahui ukurannya.
Isolasi plasmid bisa dilakukan dengan menggunakan metode minipreparasi
alkali lisis. Metode ini menggunakan dasar bahwa plasmid mempunyai ukuran yang
kecil dan bentuknya melingkar kuat, sedangkan kromosom ukuranya lebih besar dan
bentuknya kurang melingkar kuat. Dari hal ini memungkinkan pemilihan secara
selektif dengan menggunakan presipitasi (Jmu, 2008).
Plasmid penting untuk diisolasi, hal ini untuk karakteristik beberapa bakteri,
oleh karena itu, penting sekali dilakukan praktikum tentang Mini-Preparasi DNA
Plasmid.
1.2. Tujuan
Mengetahui dan Mengisolasi plasmid untuk vektor
kloning. Mengetahui dan dapat menghitung konsentrasi DNA/ RNAdengan
spektrofotometri; dapat menganalisa kualitas DNA/RNA, dan mengetahui cara
mendeteksi DNA dengan gel.
1.3. Waktu Dan Tanggal Praktikum
Waktu Praktikum : 09:00 PM- Selesai
Tanggal Praktikum : 11/12/2013
Tempat Praktikum : Laboraturium
Mikrobiologi Dan Bioteknologi Fakultas Peternakan Unuversitas Mataram
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Rekayasa
genetika merupakan salah satu ilmu terapan dalam merekayasa materi genetik
untuk kepentingan manusia. Obyek
rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan. Rekayasa
genetika sudah digunakan dalam berbagai bidang kehidupan yaitu bidang kedokteran dan farmasi, ilmu pangan, kedokteran hewan, pertanianlaporan bioteknologi (termasuk peternakan dan perikanan), serta teknik lingkungan juga telah melibatkan ilmu ini untuk mengembangkan bidang masing-masing. Rekayasa
genetika sendiri merupakan teknikn untuk memodifikasi DNA (sebagai substansi kimiawi dalam kromosom yang bertanggung jawab atas
pewarisan sifat) untuk menghasilkan produk-produk baru yang memiliki
kombinas sifat yang diinginkan (Chang 2009).
Plasmida adalah unsur genetik di luar kromosom (ekstrakromosoma) yang
mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel bakteri. DNA-nya berbentuk
lingkaran dan beruntai ganda. Dan plasmida itu mendukung gen yang diperlukan
baik untuk replikasi plasmida maupun untuk fungsi lain. Umumnya wahana plasmida
mempunya densitas apungan berlainan daripada DNA inang dan dengan mudah dapat
dimurnikan. Beberapa plasmida memiliki beberapa kemampuan untuk berintegrasi ke
dalam kromosom inang, dan plasmida ini disebut episom (Widyastuti, 2006).
Keberadaan
plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik DNA rekombinan. Keberhasilan
suatu teknik DNA rekombinan tergantung dari hasil mengisolasi dan memurnikan DNA plasmid dari bakteri atau yeast. Pemurnian DNA plasmid dilakukan
untuk menghilangkan berbagai pengotor-pengotor yang berasal dari bagian sel
yaitu dinding sel dan beberapa protein (Sambrook & Russell 2006).
Plasmid adalah DNA untai ganda yang berbentuk sirkuler yang berada diluar
DNA kromosomal bakteria. DNA ekstrakromosomal yang etrjadi secara alamiah pada
bakteria, yeast, dan beberapa sel eukaryotik yang berada secara simbiotik
maupun parasitik pada sel inang. Ukuran plasmid DNA lebih dari 100 kb.
Sebagaimana sel inang yang menggandakan DNA kromosomal, sebelum membelah
plasmid juga melakukannya (Lodish, dkk, 2004).
Dalam dunia rekombinasi, plasmid yang sering digunakan adalah plasmid dari
bakteri E. coli, hal
dikarenakan plasmid pada bakteri ini adalah plasmid yang mempunyai ukuran yang
cukup panjang, sehingga ketika direduksi, maka plasmid ini akan menghasilkan
ukuran sekitar 3 bp panjangnya (Lodish, 2000).
Isolasi plasmid bisa menggunakan metode minipreparation, dimana metode ini digunakan untuk menekstrak
DNA plasmid dari suspensi sel bakteri dan didasarkan pada prosedur alkalin
lysis yang telah dikembangkan oleh Birnboim and Doly (dalam penelitianya
tentang asam nukleat 7:1513, 1979) (Rachdie. 2008).
Dua tipe utama prosedur yang digunakan untuk memurnikan DNA adalah
sentrifugasi dan ekstraksi secara kimiawi. Prinsip-prinsip dari sentrifugasi
adalah dengan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan berat molekul. Sampel
yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi dan gaya sentrifugal menyebabkan
komponen yang lebih besar dan lebih berat akan terendap di dasar tabung yang
biasa disebut dengan pelet, sedangkan molekul yang ukuran dan beratnya lebih
kecil akan berada pada lapisan yang atas yang biasa disebut dengan supernatan.
Sebagai contoh, pemecahan sel bakteria dengan menggunakan lysozim dan detergen
akan menghasilkan larutan yang mengandung fragmen-fragmen dinding sel yang
lebih kecil dan fragmen DNA yang merupakan molekul raksasa. Apabila larutan
tersebut disentrifugasi maka DNA dan beberapa komponen besar lainnya akan
mengendap di dasar tabung sentrifus. sedangakan fragmen dinding sel bersama
dengan berbagai komponen larut lainnya bercampur pada supernatan (Calladine,.
2004)
BAB III
MATERI DAN METODE
3.1.
Materi Praktikum
3.1.1 Alat-alat praktikum
Adapun
alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini, yaitu :
1. Mikropipet
2. Tabung efendorf
3. Vortex
4. Sentrifugasi (sentrifus)
5. Tip
6. Gloves
3.1.2 Bahan-bahan praktikum
Adapun
bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini, yaitu :
Larutan 1
|
Lartan II
|
Larutan III
|
50 Mm glucose
|
0.2 NaOH (harus fresh)
|
5 M potassium acetate 60 ml
|
25 mM Tris-Cl (pH 8.0)
|
1% SDS
|
Acetic acid glacial 11.5 ml
|
10 mM EDTA (pH 8.0)
|
H2O 28.5 ml
|
Bahan-bahan
lain :
1. Etanol 10 %
2. Etanol 70 %
3. Phenolchloroform
3.2.
Metode Praktikum
Adapun
metode yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah sebagai berikut :
Ø Resusupensikan
pellet dengan 100 µl larutan I dingin. mencampur dengan merata dengan menggunakan
vortex,diulang selama 3x.
Ø Menambahkan
200µl larutan II.mecampur dengan merata dengan cara membolak balik tabung
dengan cepat beberapa kali (jangan menggunakan vortez!)
Ø Menambahkan 150µl
larutan III dingin.Vortex selama beberapa detik sehingga larutan kelihatan
tercampur kemudian balikkan posisi tabung (inverted) selamam 10 detik.
Kembalikan tabung keposisi semula dan simpan dalam kotak pendingin selama 3-5
menit.
Ø Paratikan
melakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 5 menit pada suhu 4ºc ,setelah
sentrifugasi ,ambil supernatant dan pindahkan ke tabung lain.
Ø Menambahkan phenol:chloroform
dengan perbandingan volume 1:1 dengan jumlah supernatant yang diperoleh
,misalkan volume supernatant yang diperoleh adalah 300 µl.
Ø Mencampur
dengan merata dengan menggunakan vortex kemudian lakukan sentrifugasi (12,000
rpm) selama 2 menit pada suhu 4ºc.
Ø Setelah
sentrifugasi, praktikan mengambil supernatant dan pindahkan ke dalam tabung
lain.
Ø Menambahkan etanol
(2x volume supernatant ) untuk memperesipitasikan DNA.Campur dengan vortex,
kemudian biarkan pada suhu kamar selama 2 menit.
Ø Melakukan sentrifugasi
12,000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºc.
Ø Membuang supernatant
perlahan lahan ,balikkan tabung dan biarkan kering udara selama beberapa menit.
Ø Membilas DNA
pellet dengan ethanol 70% (dingin) kemudian sentrifugasi seperti cara no 9.
Ø Membuang supernatant,
balikkan tabung dan biarkan kering udara selama 10 menit.
Ø Resuspensi
DNA dengan 25 µl buffer TE(Ph 8.0)
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Hasil Praktikum
Adapun hasil dari Isolasi DNA Plasmid
kali ini adalah :
Dapat diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri, ada
tiga tahappenting yang perlu dilakukan yaitu :
1. Lisis membran sel bakteri
2. Ektraksi DNA
3. Pengendapan DNA.
Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana
SDS (sodium dodesil sulphate) merupakan deterjen yang
berperan untuk melisis dinding atau membransel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa berfungsi untuk denaturasi protein atau
DNA (DNA doublestrain menjadi single strain). Terjadinya
proses lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. Kemudian larutan disentrifugasi untuk diambil
supernatannya berupa lautan suspensi.
Suprnatan
Pelet
Gambar 1. Ekstraksi DNA
Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi,
terdapat senyawa DNA plasmid, RNA, Protein, Senyawa Organik dan Komponen Lipid. Ekstraksi dilakukan dengan adanya penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform
berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan
komponen lipid. Dengan dilakukannya
ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3
fase dimana terdiridari fase air yang ada di paling
atas tempat DNA
plasmid berada,
protein yang terkoagulasi
di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang
ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar.
Gambar 2. Pemurnian DNA dengan etanol
Fase air yang
di ambil kemudian di endapkan menggunakan sodium acetat untuk menciptakan kondisi
netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga
DNA mengendap dengan sentrifugasi.
Pelet yang di dapat kemudian di murnikan dengan
menambah etanol 170% yang kemudian di sentrifugasi untuk di dapatkan pelet. Pada tahap ini tidak perlu dilakukan resuspensi karena apabil dilakukan resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netrallagi. Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA setelah
dilakukan pemurnian dan proses vakum dengan bantuan larutan buffer TE ataupun dH2O.
4.2. Pembahasan
Plasmid
adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang
terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Plasmid tersebar luas di
antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar 1 kb
hingga lebih dari 250 kb (1 kb = 1000 pb). Agar dapat digunakan sebagai vektor
kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat berikut ini:
1. Mempunyai
ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga
dapat dengan mudah melintasinya,
2. Mempunyai
sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke
dalam sel inang,
3. Mempunyai
tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang
dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen dna, dan
4. Mempunyai titik
awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel inang.
Pada
dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi
DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan tersebut
adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA
menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan
fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan,
transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul
DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.
Isolasi DNA
diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan
baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun
dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah
lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi
di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu
diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium
dodesil sulfat. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih
tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA
dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan
penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan
menggunakan CsCl.
Teknik
isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA
vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini
yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada
umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai
bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih
longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi.
Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi
apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi
denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
Pendekatan
kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang
menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid
akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap
oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan
etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada
kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi
kerapatan.
DNA plasmid
merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di
pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil
daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan
yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan
penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA,
protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan
penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan
cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang
tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi
RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.
Gen-gen yang
terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan
kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis
protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid
sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan
ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan
produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.
Plasmid yang
diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation
karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar
(100-200µg) dinamakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang
lebih besar dari 200 µg.
Inti dari
isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel
sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal
(plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris
membran sel, organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk
isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis,
alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan
dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki
perbedaan sifat pada keadaan alkalis.
Penambahan
kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded
DNA karena molekulnyayang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan
kadar garam tinggi, pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan
mudah terbuang. Yang perlu diperhatikan pada tahap ini adalah proses renaturasi
pada DNA plasmid lebih cepat daripada renaturasi dari DNA kromosomal. Penambahan
etanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas,
etanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang
mengendap. Selanjutnya untuk menghilangkan pengotor yang masih ada ditambahkan
etanol 70% sehingga sisa etanol yang tersisa dapat diuapkan dengan evaporasi.
Komponen
penting dalam eksperimen kloning gen adalah vektor yang membawa gen masuk sel
inang dan bertanggung jawab atas replikasinya. Untuk dapat bertindak sebagai
vektor suatu molekul DNA harus mampu memasuki sel inang serta mengadakan
replikasi untuk menghasilkan kopi dalam jumlah yang besar. Salah satu vektor
penting yang sering digunakan dalam kloning gen adalah plasmid. Plasmid adalah
molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di
dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid
pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu
bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap
antibiotik.
Dalam
rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen
tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya
akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan
berbagai enzim. Ukuran plasmid berkisar antara 1 kb untuk yang terkecil dan
lebih dari 250 kb untuk yang besar. Ukuran kurang dari 10 kb adalah yang
terbaik untuk vektor kloning.
Setelah
didapatkan ekstrak sel, langkah pertama dalam proses isolasi DNA adalah
perusakan dan atau pembuangan dinding sel bakteri inang dapat dilakukan dengan
cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh maupun dengan cara
enzimatis seperti pemberian lisozim. Pada praktikum acara ini, perusakan
dinding sel dilakukan dengan pemberian STE sebanyak 1 ml kedalam pelet
sel hasil sentrifugasi pertama.
Molekul supercoiled
ini jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA
kromosom dan dapat dipisahkan dengan dua cara yaitu: denaturasi dengan alkali,
dan pemurnian berdasarkan kerapatan apung (bouyant density) atau dikenal dengan
istilah equilibrium density gradient centrifugation atau sentrifugasi
isopiknik.
Langkah
berikutnya dalam isolasi DNA adalah lisis sel, dimana pada acara ini digunakan
buffer P1 dan P2. Buffer P1 sebelumnya telah ditambah dengan enzim RNAse A dan
deterjen Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dan indikator LyseBlue. RNAse dan SDS
adalah kombinasi untuk tujuan perusakan dinding dan lisis sel. Pada pH 12 -12,5
ikatan hidrogen dari DNA kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks
ganda terurai dan kedua rantai polipeptida memisah.
Proses
re-naturasi selanjutnya dilakukan dengan cara mengembalikan DNA pada kondisi
asam yaitu dengan penambahan buffer N3 yang mengandung asam asetat.
Pemberian asam akan menyebabkan DNA bakteri yang sebelumnya terdenaturasi,
mengelompok dalam massa DNA linier yang kusut. Sentrifugasi selanjutnya pada
kecepatan 13000 selama 10 menit akan mengendapkan massa DNA ini di dasar tabung
sentrifugasi dan meninggalkan plasmid murni dalam supernatan.
Penambahan
RNAse A (ribonuklease) dan SDS di buffer pertama (P1) menyebabkan sebagian
besar protein dan RNA menjadi tidak larut dan dapat dihilangkan pada tahap
sentrifugasi (ikut mengendap bersama massa DNA, dinding serta debris sel
lainnya). Presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform
untuk menghilangkan sisa protein, tidak perlu dilakukan jika kita menggunakan
metode denaturasi alkali.
Supernatan
berisi plasmid murni kemudian dicuci dua kali menggunakan buffer PB isinya
mengandung isopropanol dan buffer PE yang mengandung 96 – 100% ethanol. Dari
Qiaprep spin column, supernatan plasmid kemudian dipindahkan ke tabung
mikrosentrifuse baru dan di elusi dua kali dengan buffer EB (Elution Buffer)
dimana masing- masing melewati sentrifugasi pada 13000 rpm selama satu menit.
Hasil elusi inilah DNA plasmid yang telah berhasil kita isolasi dari E.coli.
BAB V
PENUTUP
5.1. Kesimpulan
1. DNA
plasmid merupakan wadah untuk cloning gen serta mempunyai ukuran yang lebih
kecil.
2. Plasmid
tersebar luas di antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari
sekitar 1 kb hingga lebih dari 250 kb (1 kb = 1000 pb).
3. DNA
plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA
kromosom
4. Aplikasi
kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
5.2. Saran
1. Praktikan lebih teliti dalam mengamati perubahan-perubahan proses dalam
plasmid isolasi DNA.
2. Praktikan lebih berhati-hati dalam melakukan praktikum agar alat-alat
praktikum tidak mudah rusak.
3. Praktikan harus menjaga kesterilan alat-alat praktikum dan menjaga
kesterilan tubuh sehingga tidak terkontaminasi dengan mikroba.
DAFTAR PUSTAKA
Calladine,
C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T. 2004. UNDERSTANDING DNA. Academic Press. Amsterdam.
Chang W. 2009. Bioetika sebuah
pengantar. Yogyakarta: Kanisius.
Lodish, H.,
Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B. James D. 2000. MOLECULAR CELL BIOLOGY. Wh Freeman
Company
Rachdie. 2008. isolasi plasmid.
http://rachdie.blogsome.Com /2006/11/02/teknik-dasar-analisa-biologi-molekuler-2/.
Tanggal akses
17 Maret 2013.
Sambrook, Russell. 2006. The Condensed Protocols From Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory
Press.
Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Reaksi berantai polimerase atau
lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris
polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik
ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat
sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini
dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada
tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang
biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah
sampel yang kecil.
Polymerase chain reaction
("reaksi [be]rantai polimerase", PCR) merupakan teknik yang sangat
berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA
tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis),
atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk
menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa
tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens
DNA tertentu dalam sampel.
PCR memanfaatkan enzim DNA
polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses
replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada organisme hidup, proses PCR hanya
dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo base
pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau
hanya bagian dari suatu gen.
Proses PCR untuk memperbanyak DNA
melibatkan serangkaian siklus temperatur yang berulang dan masing-masing siklus
terdiri atas tiga tahapan. Tahapan yang pertama adalah denaturasi cetakan DNA
(DNA template) pada temperatur 94-96 °C, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi
dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan penurunan temperatur pada tahap kedua
sampai 45-60 °C yang memungkinkan terjadinya penempelan (annealing) atau
hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA.
Primer merupakan oligonukelotida utas tunggal yang sekuens-nya dirancang
komplementer dengan ujung fragmen DNA yang ingin disalin; primer menentukan awal
dan akhir daerah yang hendak disalin. Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi
atau elongasi (elongation), yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA
baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis
DNA polimerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan
jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap utas baru yang
disintesis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya.
1.2 Tujuan dan Manfaat Praktikum
1.2.1 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum yaitu :
• Untuk mengetahui takhnik dan cara melakukan PCR
• Untuk memperbanyak DNA yang diinginkan secara in vitro atau di luar sel.
• Digunakan dalam penelitian biologi seperti mengamati penyakit keturunan, identifikasi sidik jari, kloning DNA dan untuk mengamati kekerabatan antar spesies secara molekuler
1.2.2 Manfaat Praktikum
Adapun manfaat dari praktikum yaitu :
• Mahasiswa dapat mengetahui apa itu PCR. Baik dalam pembuatan gel,mengetahui alat-alat dan metode yang digunakan dalam PCR, maupun dalm mengetahui proses dalam melakukan PCR.
1.3 Waktu Dan Tanggal Praktikum
Waktu Praktikum : 09:00 PM
Tanggal Praktikum : 11/12/2013
Tempat Praktikum : Laboraturium
Mikrobiologi Dan Bioteknologi Fakultas Peternakan Unuversitas Mataram
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Elektroforesis merupakan
proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu
medan listrik. Kecepatan molekul yang
bergerak pada medan listrik tergantung pada
muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan
asam nukleat).Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi
dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan
kuantifikasi dengan densitometer.Elektroforesis untuk
makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas
dari arus listrik yang digunakan.Elektroforesis
biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat
bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media
penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan
dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam
elektroforesis antara lain yaitu kertas,
selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid
dan agarosa merupakan matriks penyangga
yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.
Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein
yakni: (Soedarmadji, 1996)
1. Ukuran molekul protein
Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.
2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.
2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium
pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion
sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer
akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi
maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan
molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga
aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.
4. Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang
bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai
daya serap yang baik,
sebagai migrasi elektron atau penyaringan
berdasarkan ukuran molekulseperti gel poliakrilamid (Pratiwi, 2001).
5. Kekuatan voltase
1.
Jika ukuran pori dari medium kira-kira
sama dengan molekul, maka molekul yang
lebih kecil akan berpindah lebih bebas
di dalam medan listrik, sedangkan molekul
yang lebih besar akan dibatasi dalam
migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur
dengan mengubah konsentrasi penyusun gel
poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid
2.
Voltase yang dipakai rendah (100-500) V,
kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang
digunakan.
3.
Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara
lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah
serta jenis arus yang dipakai selalu
harus searah (bukan bolak balik).
6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung.
Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses
bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur
rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.Pada saat elektroforesis
berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda
positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat
molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh
pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein
dengan berat molekul lebih besar akan bergerak
pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya
rendah (Sumitro, 1996).
Hasil elektroforesis
akan didapatkan pita-pita protein yang
terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal
tipisnya pita yang terbentuk dari pita
protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein
yang mempunyai berat molekul yang sama yang
berada pada posisi pita yang sama. Hal ini
sejalan dengan prinsippergerakan molekul bermuatan,
yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di
bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama
akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji,
1996).
BAB III
MATERI DAN
METODE PRAKTIKUM
3.1 Materi Praktikum
3.1.1 Alat dan Bahan Praktikum.
Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :
1.
Mesin PCR
2.
Elektroforesis
3.
Transiluminator sinar UV
4.
Mikro pipet
5.
Tabung ependorf
6.
Gloves (sarung tangan)
3.1.2 Bahan Praktikum
Adapun bahan
- bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :
1.
Air steril
: 6,7 µl
2.
10 x buffer TAQ
: 10 µl
3.
2,5 Mm dNTP mix :
10 µl
4.
10 µM primer foward : 10 µl
5.
10 µM primer reverse : 10 µl
6.
Template
: 10 µl
7.
Enzim
: 5 µl
3.2 Metode Praktikum
Adapun
metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :
1.
Mengambil air steril sebanyak 6,7 µl dan
dimasukkan dalam tabung PCR
2.
Menambahkan 10 x buffre TAQ dan dimasukkan dalam
tabung PCR
3.
Menambahkan 2,5 mM dNTP mix sebanyak 0,4 µl
4.
Menambahkan 10 µM primer forward sebanyak 0,4 µl
5.
Menambahkan 10 µM primer reverse sebanyak 0,4 µl
6.
Menambahkan template 1 µl
7.
Menambahkan enzim polimerase sebanyak 0,1 µl
8.
Setelah itu di mix supaya homogen dan dimasukkan dalam
mesin PCR yang sebelumnya sudah diatur programnya.
9.
Hasil PCR tadi dimasukkan dalam elektroforesis
10. Menambahkan
looding late supaya kelihatan, dan dimasukkan pada masing-masing lubang gel 1 –
4, tunggu selama 10 menitKemudian diamati di transimlator sinar UV.
BAB IV
HASIL DAN
PEMBAHASAN
4.1 Hasil Praktikum :
Hasil praktikum yang didapatkan dari PCR lubang gel 1-4 terdapat 2 lubang yaitu
positif dan negatif. Seperti yang terlihat pada gambar dibawah ini.
Gambar 1. Hasil digesti DNA plasmid mengunakan beberapa enzim restriksi
4.2
Pembahasan
Reaksi PCR mulai menghasilkan salinan urutan target secara eksponensial.
Hanya selama fase eksponensial dari reaksi PCR adalah mungkin untuk
ekstrapolasi kembali untuk menentukan kuantitas awal dari urutan target yang
terkandung dalam sampel. Karena inhibitor dari reaksi polimerase ditemukan
dalam sampel, keterbatasan reagen, akumulasi molekul pirofosfat, dan self-anil
dari produk mengumpulkan, reaksi PCR akhirnya berhenti untuk memperkuat urutan
target pada tingkat eksponensial dan "dataran tinggi efek" terjadi,
membuat titik akhir kuantifikasi produk PCR dapat diandalkan. Ini adalah
atribut yang membuat PCR Real-Time RT-PCR kuantitatif sangat diperlukan.
DNA template
- sampel DNA yang berisi urutan target. Pada awal reaksi, suhu tinggi
diterapkan untuk molekul DNA beruntai ganda yang asli untuk memisahkan alur
dari satu sama lain.
DNA polimerase - jenis enzim yang mensintesis untai DNA komplementer baru ke
urutan target. Yang pertama dan paling umum digunakan adalah enzim-enzim Taq
DNA polimerase (dari aquaticus Thermis), sedangkan PFU DNA polimerase (dari
Pyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena kesetiaan yang lebih tinggi
saat menyalin DNA. Meskipun enzim ini agak berbeda, mereka berdua memiliki dua
kemampuan yang membuat mereka cocok untuk PCR: Mereka dapat menghasilkan untai
DNA baru menggunakan template DNA dan primer,Mereka tahan terhadap panas Primer
- potongan pendek DNA beruntai tunggal yang melengkapi urutan target.
Polimerase dimulai sintesis DNA baru dari ujung primer.
Nukleotida (dNTP atau trifosfat
deoksinukleotida) - unit tunggal dari basa A, T, G, dan C, yang pada dasarnya
"blok bangunan" untuk untai DNA baru. RT-PCR (PCR Transkripsi
Reverse) yang didahului dengan konversi PCR RNA sampel ke cDNA dengan enzim
reverse transcriptase.
Ada beberapa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR, antara lain
sebagai berikut :
1.
Pada saat pengambila gel salah
2.
Pengambilan frimer ataupun reverse tertukar
3.
Enzim
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Elektroforesis merupakan
proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu
medan listrik. Kecepatan molekul yang
bergerak pada medan listrik tergantung pada
muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan
asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi
dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan
kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk
makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya
panas dari arus listrik yang digunakan. Gel
poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks
penyangga yang banyak dipakai untuk separasi
protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang
dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida
(PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) untuk
separasi sampel protein. Banyak molekul biologi
bermuatan listrik yang besarnya tergantung
pada pH dan komposisi medium dimana molekul
biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam
suatu medan listrik, molekul biologi yang
bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda
negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang
dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul
berdasarkan muatannya.
Cara kerja menggunakan metode
elktroforesis adalah:
1) Ektraksi enzim
2) Pembuatan gel
3) Penempatan sampel
4) Proses Elektroforesis
5) Visualisasi sistem enzim
6) Metode Analisis.
5.2
Saran
Saran pada praaktikum kali ini
adalah sebaiknya praktikum dilakukan oleh praktikan sendiri
dan dilkukan proses elektroforesis yang
sebenarnya supaya praktikan lebih mengetahi cara menggunakan metode
elektroforesis
DAFTAR PUSTAKA
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1.
Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta
Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama.Liberty.
Yogyakarta.
Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus
Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Brawijaya. Malang
LAMPIRAN
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar belakang
Plasmid
adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif
kecil di luar kromosom yang terdapat
di dalam sel prokariot, khususnya bakteri
dan sel eukariotik tingkat rendah . DNA plasmid
berukuran lebih kecil dari DNA kromosom dan dapat bereplikasi sendiri. Plasmid
biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E.
coli sebagai host, sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering
digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang.
Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan
produk komersial tertentu seperti insulin,
interferon, dan berbagai enzim (Stanfield 1996). Penggunaan plasmid
dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang
berperan penting untuk DNA kloning, yaitu, replication origin, marker
yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen
resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi
oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al).
Elektroforesis
DNA merupakan teknik untuk memisahkan
sampel DNA berdasarkan ukuran (berat
molekul) dan struktur fisik molekulnya. Posisi molekul
yang terpisah pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,
ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk
makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi
karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan
agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk pemisahan protein
dan asam nukleat (DNA). Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi
yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya.
Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul
berdasarkan muatannya. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan
listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif . Makin besar
ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat
molekul suatu fragmen DNA dapat
diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi
fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah
diketahui ukurannya.
Isolasi plasmid bisa dilakukan dengan menggunakan metode minipreparasi
alkali lisis. Metode ini menggunakan dasar bahwa plasmid mempunyai ukuran yang
kecil dan bentuknya melingkar kuat, sedangkan kromosom ukuranya lebih besar dan
bentuknya kurang melingkar kuat. Dari hal ini memungkinkan pemilihan secara
selektif dengan menggunakan presipitasi (Jmu, 2008).
Plasmid penting untuk diisolasi, hal ini untuk karakteristik beberapa bakteri,
oleh karena itu, penting sekali dilakukan praktikum tentang Mini-Preparasi DNA
Plasmid.
1.2. Tujuan
Mengetahui dan Mengisolasi plasmid untuk vektor
kloning. Mengetahui dan dapat menghitung konsentrasi DNA/ RNAdengan
spektrofotometri; dapat menganalisa kualitas DNA/RNA, dan mengetahui cara
mendeteksi DNA dengan gel.
1.3. Waktu Dan Tanggal Praktikum
Waktu Praktikum : 09:00 PM- Selesai
Tanggal Praktikum : 11/12/2013
Tempat Praktikum : Laboraturium
Mikrobiologi Dan Bioteknologi Fakultas Peternakan Unuversitas Mataram
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Rekayasa
genetika merupakan salah satu ilmu terapan dalam merekayasa materi genetik
untuk kepentingan manusia. Obyek
rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan. Rekayasa
genetika sudah digunakan dalam berbagai bidang kehidupan yaitu bidang kedokteran dan farmasi, ilmu pangan, kedokteran hewan, pertanian (termasuk peternakan dan perikanan), serta teknik lingkungan juga telah melibatkan ilmu ini untuk mengembangkan bidang masing-masing. Rekayasa
genetika sendiri merupakan teknikn untuk memodifikasi DNA (sebagai substansi kimiawi dalam kromosom yang bertanggung jawab atas
pewarisan sifat) untuk menghasilkan produk-produk baru yang memiliki
kombinas sifat yang diinginkan (Chang 2009).
Plasmida adalah unsur genetik di luar kromosom (ekstrakromosoma) yang
mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel bakteri. DNA-nya berbentuk
lingkaran dan beruntai ganda. Dan plasmida itu mendukung gen yang diperlukan
baik untuk replikasi plasmida maupun untuk fungsi lain. Umumnya wahana plasmida
mempunya densitas apungan berlainan daripada DNA inang dan dengan mudah dapat
dimurnikan. Beberapa plasmida memiliki beberapa kemampuan untuk berintegrasi ke
dalam kromosom inang, dan plasmida ini disebut episom (Widyastuti, 2006).
Keberadaan
plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik DNA rekombinan. Keberhasilan
suatu teknik DNA rekombinan tergantung dari hasil mengisolasi dan memurnikan DNA plasmid dari bakteri atau yeast. Pemurnian DNA plasmid dilakukan
untuk menghilangkan berbagai pengotor-pengotor yang berasal dari bagian sel
yaitu dinding sel dan beberapa protein (Sambrook & Russell 2006).
Plasmid adalah DNA untai ganda yang berbentuk sirkuler yang berada diluar
DNA kromosomal bakteria. DNA ekstrakromosomal yang etrjadi secara alamiah pada
bakteria, yeast, dan beberapa sel eukaryotik yang berada secara simbiotik
maupun parasitik pada sel inang. Ukuran plasmid DNA lebih dari 100 kb.
Sebagaimana sel inang yang menggandakan DNA kromosomal, sebelum membelah
plasmid juga melakukannya (Lodish, dkk, 2004).
Dalam dunia rekombinasi, plasmid yang sering digunakan adalah plasmid dari
bakteri E. coli, hal
dikarenakan plasmid pada bakteri ini adalah plasmid yang mempunyai ukuran yang
cukup panjang, sehingga ketika direduksi, maka plasmid ini akan menghasilkan
ukuran sekitar 3 bp panjangnya (Lodish, 2000).
Isolasi plasmid bisa menggunakan metode minipreparation, dimana metode ini digunakan untuk menekstrak
DNA plasmid dari suspensi sel bakteri dan didasarkan pada prosedur alkalin
lysis yang telah dikembangkan oleh Birnboim and Doly (dalam penelitianya
tentang asam nukleat 7:1513, 1979) (Rachdie. 2008).
Dua tipe utama prosedur yang digunakan untuk memurnikan DNA adalah
sentrifugasi dan ekstraksi secara kimiawi. Prinsip-prinsip dari sentrifugasi
adalah dengan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan berat molekul. Sampel
yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi dan gaya sentrifugal menyebabkan
komponen yang lebih besar dan lebih berat akan terendap di dasar tabung yang
biasa disebut dengan pelet, sedangkan molekul yang ukuran dan beratnya lebih
kecil akan berada pada lapisan yang atas yang biasa disebut dengan supernatan.
Sebagai contoh, pemecahan sel bakteria dengan menggunakan lysozim dan detergen
akan menghasilkan larutan yang mengandung fragmen-fragmen dinding sel yang
lebih kecil dan fragmen DNA yang merupakan molekul raksasa. Apabila larutan
tersebut disentrifugasi maka DNA dan beberapa komponen besar lainnya akan
mengendap di dasar tabung sentrifus. sedangakan fragmen dinding sel bersama
dengan berbagai komponen larut lainnya bercampur pada supernatan (Calladine,.
2004)
BAB III
MATERI DAN METODE
3.1.
Materi Praktikum
3.1.1 Alat-alat praktikum
Adapun
alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini, yaitu :
1. Mikropipet
2. Tabung efendorf
3. Vortex
4. Sentrifugasi (sentrifus)
5. Tip
6. Gloves
3.1.2 Bahan-bahan praktikum
Adapun
bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini, yaitu :
Larutan 1
|
Lartan II
|
Larutan III
|
50 Mm glucose
|
0.2 NaOH (harus fresh)
|
5 M potassium acetate 60 ml
|
25 mM Tris-Cl (pH 8.0)
|
1% SDS
|
Acetic acid glacial 11.5 ml
|
10 mM EDTA (pH 8.0)
|
H2O 28.5 ml
|
Bahan-bahan
lain :
1. Etanol 10 %
2. Etanol 70 %
3. Phenolchloroform
3.2.
Metode Praktikum
Adapun
metode yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah sebagai berikut :
Ø Resusupensikan
pellet dengan 100 µl larutan I dingin. mencampur dengan merata dengan menggunakan
vortex,diulang selama 3x.
Ø Menambahkan
200µl larutan II.mecampur dengan merata dengan cara membolak balik tabung
dengan cepat beberapa kali (jangan menggunakan vortez!)
Ø Menambahkan 150µl
larutan III dingin.Vortex selama beberapa detik sehingga larutan kelihatan
tercampur kemudian balikkan posisi tabung (inverted) selamam 10 detik.
Kembalikan tabung keposisi semula dan simpan dalam kotak pendingin selama 3-5
menit.
Ø Paratikan
melakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 5 menit pada suhu 4ºc ,setelah
sentrifugasi ,ambil supernatant dan pindahkan ke tabung lain.
Ø Menambahkan phenol:chloroform
dengan perbandingan volume 1:1 dengan jumlah supernatant yang diperoleh
,misalkan volume supernatant yang diperoleh adalah 300 µl.
Ø Mencampur
dengan merata dengan menggunakan vortex kemudian lakukan sentrifugasi (12,000
rpm) selama 2 menit pada suhu 4ºc.
Ø Setelah
sentrifugasi, praktikan mengambil supernatant dan pindahkan ke dalam tabung
lain.
Ø Menambahkan etanol
(2x volume supernatant ) untuk memperesipitasikan DNA.Campur dengan vortex,
kemudian biarkan pada suhu kamar selama 2 menit.
Ø Melakukan sentrifugasi
12,000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºc.
Ø Membuang supernatant
perlahan lahan ,balikkan tabung dan biarkan kering udara selama beberapa menit.
Ø Membilas DNA
pellet dengan ethanol 70% (dingin) kemudian sentrifugasi seperti cara no 9.
Ø Membuang supernatant,
balikkan tabung dan biarkan kering udara selama 10 menit.
Ø Resuspensi
DNA dengan 25 µl buffer TE(Ph 8.0)
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Hasil Praktikum
Adapun hasil dari Isolasi DNA Plasmid
kali ini adalah :
Dapat diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri, ada
tiga tahappenting yang perlu dilakukan yaitu :
1. Lisis membran sel bakteri
2. Ektraksi DNA
3. Pengendapan DNA.
Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana
SDS (sodium dodesil sulphate) merupakan deterjen yang
berperan untuk melisis dinding atau membransel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa berfungsi untuk denaturasi protein atau
DNA (DNA doublestrain menjadi single strain). Terjadinya
proses lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. Kemudian larutan disentrifugasi untuk diambil
supernatannya berupa lautan suspensi.
Suprnatan Pelet
Gambar 1. Ekstraksi DNA
Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi,
terdapat senyawa DNA plasmid, RNA, Protein, Senyawa Organik dan Komponen Lipid. Ekstraksi dilakukan dengan adanya penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform
berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan
komponen lipid. Dengan dilakukannya
ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3
fase dimana terdiridari fase air yang ada di paling
atas tempat DNA
plasmid berada,
protein yang terkoagulasi
di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang
ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar.
Gambar 2. Pemurnian DNA dengan etanol
Fase air yang
di ambil kemudian di endapkan menggunakan sodium acetat untuk menciptakan kondisi
netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga
DNA mengendap dengan sentrifugasi.
Pelet yang di dapat kemudian di murnikan dengan
menambah etanol 170% yang kemudian di sentrifugasi untuk di dapatkan pelet. Pada tahap ini tidak perlu dilakukan resuspensi karena apabil dilakukan resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netrallagi. Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA setelah
dilakukan pemurnian dan proses vakum dengan bantuan larutan buffer TE ataupun dH2O.
4.2. Pembahasan
Plasmid
adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang
terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Plasmid tersebar luas di
antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar 1 kb
hingga lebih dari 250 kb (1 kb = 1000 pb). Agar dapat digunakan sebagai vektor
kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat berikut ini:
1. Mempunyai
ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga
dapat dengan mudah melintasinya,
2. Mempunyai
sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke
dalam sel inang,
3. Mempunyai
tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang
dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen dna, dan
4. Mempunyai titik
awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel inang.
Pada
dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi
DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan tersebut
adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA
menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan
fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan,
transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul
DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.
Isolasi DNA
diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan
baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun
dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah
lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi
di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu
diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium
dodesil sulfat. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih
tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA
dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan
penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan
menggunakan CsCl.
Teknik
isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA
vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini
yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada
umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai
bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih
longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi.
Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi
apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi
denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
Pendekatan
kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang
menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid
akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap
oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan
etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada
kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi
kerapatan.
DNA plasmid
merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di
pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil
daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan
yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan
penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA,
protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan
penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan
cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang
tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi
RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.
Gen-gen yang
terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan
kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis
protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid
sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan
ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan
produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.
Plasmid yang
diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation
karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar
(100-200µg) dinamakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang
lebih besar dari 200 µg.
Inti dari
isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel
sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal
(plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris
membran sel, organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk
isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis,
alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan
dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki
perbedaan sifat pada keadaan alkalis.
Penambahan
kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded
DNA karena molekulnyayang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan
kadar garam tinggi, pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan
mudah terbuang. Yang perlu diperhatikan pada tahap ini adalah proses renaturasi
pada DNA plasmid lebih cepat daripada renaturasi dari DNA kromosomal. Penambahan
etanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas,
etanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang
mengendap. Selanjutnya untuk menghilangkan pengotor yang masih ada ditambahkan
etanol 70% sehingga sisa etanol yang tersisa dapat diuapkan dengan evaporasi.
Komponen
penting dalam eksperimen kloning gen adalah vektor yang membawa gen masuk sel
inang dan bertanggung jawab atas replikasinya. Untuk dapat bertindak sebagai
vektor suatu molekul DNA harus mampu memasuki sel inang serta mengadakan
replikasi untuk menghasilkan kopi dalam jumlah yang besar. Salah satu vektor
penting yang sering digunakan dalam kloning gen adalah plasmid. Plasmid adalah
molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di
dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid
pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu
bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap
antibiotik.
Dalam
rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen
tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya
akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan
berbagai enzim. Ukuran plasmid berkisar antara 1 kb untuk yang terkecil dan
lebih dari 250 kb untuk yang besar. Ukuran kurang dari 10 kb adalah yang
terbaik untuk vektor kloning.
Setelah
didapatkan ekstrak sel, langkah pertama dalam proses isolasi DNA adalah
perusakan dan atau pembuangan dinding sel bakteri inang dapat dilakukan dengan
cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh maupun dengan cara
enzimatis seperti pemberian lisozim. Pada praktikum acara ini, perusakan
dinding sel dilakukan dengan pemberian STE sebanyak 1 ml kedalam pelet
sel hasil sentrifugasi pertama.
Molekul supercoiled
ini jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA
kromosom dan dapat dipisahkan dengan dua cara yaitu: denaturasi dengan alkali,
dan pemurnian berdasarkan kerapatan apung (bouyant density) atau dikenal dengan
istilah equilibrium density gradient centrifugation atau sentrifugasi
isopiknik.
Langkah
berikutnya dalam isolasi DNA adalah lisis sel, dimana pada acara ini digunakan
buffer P1 dan P2. Buffer P1 sebelumnya telah ditambah dengan enzim RNAse A dan
deterjen Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dan indikator LyseBlue. RNAse dan SDS
adalah kombinasi untuk tujuan perusakan dinding dan lisis sel. Pada pH 12 -12,5
ikatan hidrogen dari DNA kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks
ganda terurai dan kedua rantai polipeptida memisah.
Proses
re-naturasi selanjutnya dilakukan dengan cara mengembalikan DNA pada kondisi
asam yaitu dengan penambahan buffer N3 yang mengandung asam asetat.
Pemberian asam akan menyebabkan DNA bakteri yang sebelumnya terdenaturasi,
mengelompok dalam massa DNA linier yang kusut. Sentrifugasi selanjutnya pada
kecepatan 13000 selama 10 menit akan mengendapkan massa DNA ini di dasar tabung
sentrifugasi dan meninggalkan plasmid murni dalam supernatan.
Penambahan
RNAse A (ribonuklease) dan SDS di buffer pertama (P1) menyebabkan sebagian
besar protein dan RNA menjadi tidak larut dan dapat dihilangkan pada tahap
sentrifugasi (ikut mengendap bersama massa DNA, dinding serta debris sel
lainnya). Presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform
untuk menghilangkan sisa protein, tidak perlu dilakukan jika kita menggunakan
metode denaturasi alkali.
Supernatan
berisi plasmid murni kemudian dicuci dua kali menggunakan buffer PB isinya
mengandung isopropanol dan buffer PE yang mengandung 96 – 100% ethanol. Dari
Qiaprep spin column, supernatan plasmid kemudian dipindahkan ke tabung
mikrosentrifuse baru dan di elusi dua kali dengan buffer EB (Elution Buffer)
dimana masing- masing melewati sentrifugasi pada 13000 rpm selama satu menit.
Hasil elusi inilah DNA plasmid yang telah berhasil kita isolasi dari E.coli.
BAB V
PENUTUP
5.1. Kesimpulan
1. DNA
plasmid merupakan wadah untuk cloning gen serta mempunyai ukuran yang lebih
kecil.
2. Plasmid
tersebar luas di antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari
sekitar 1 kb hingga lebih dari 250 kb (1 kb = 1000 pb).
3. DNA
plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA
kromosom
4. Aplikasi
kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
5.2. Saran
1. Praktikan lebih teliti dalam mengamati perubahan-perubahan proses dalam
plasmid isolasi DNA.
2. Praktikan lebih berhati-hati dalam melakukan praktikum agar alat-alat
praktikum tidak mudah rusak.
3. Praktikan harus menjaga kesterilan alat-alat praktikum dan menjaga
kesterilan tubuh sehingga tidak terkontaminasi dengan mikroba.
DAFTAR PUSTAKA
Calladine,
C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T. 2004. UNDERSTANDING DNA. Academic Press. Amsterdam.
Chang W. 2009. Bioetika sebuah
pengantar. Yogyakarta: Kanisius.
Lodish, H.,
Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B. James D. 2000. MOLECULAR CELL BIOLOGY. Wh Freeman
Company
Rachdie. 2008. isolasi plasmid.
http://rachdie.blogsome.Com /2006/11/02/teknik-dasar-analisa-biologi-molekuler-2/.
Tanggal akses
17 Maret 2013.
Sambrook, Russell. 2006. The Condensed Protocols From Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory
Press.
Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Reaksi berantai polimerase atau
lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris
polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik
ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat
sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini
dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada
tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang
biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah
sampel yang kecil.
Polymerase chain reaction
("reaksi [be]rantai polimerase", PCR) merupakan teknik yang sangat
berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA
tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis),
atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk
menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa
tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens
DNA tertentu dalam sampel.
PCR memanfaatkan enzim DNA
polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses
replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada organisme hidup, proses PCR hanya
dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo base
pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau
hanya bagian dari suatu gen.
Proses PCR untuk memperbanyak DNA
melibatkan serangkaian siklus temperatur yang berulang dan masing-masing siklus
terdiri atas tiga tahapan. Tahapan yang pertama adalah denaturasi cetakan DNA
(DNA template) pada temperatur 94-96 °C, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi
dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan penurunan temperatur pada tahap kedua
sampai 45-60 °C yang memungkinkan terjadinya penempelan (annealing) atau
hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA.
Primer merupakan oligonukelotida utas tunggal yang sekuens-nya dirancang
komplementer dengan ujung fragmen DNA yang ingin disalin; primer menentukan awal
dan akhir daerah yang hendak disalin. Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi
atau elongasi (elongation), yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA
baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis
DNA polimerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan
jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap utas baru yang
disintesis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya.
1.2 Tujuan dan Manfaat Praktikum
1.2.1 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum yaitu :
• Untuk mengetahui takhnik dan cara melakukan PCR
• Untuk memperbanyak DNA yang diinginkan secara in vitro atau di luar sel.
• Digunakan dalam penelitian biologi seperti mengamati penyakit keturunan, identifikasi sidik jari, kloning DNA dan untuk mengamati kekerabatan antar spesies secara molekuler
1.2.2 Manfaat Praktikum
Adapun manfaat dari praktikum yaitu :
• Mahasiswa dapat mengetahui apa itu PCR. Baik dalam pembuatan gel,mengetahui alat-alat dan metode yang digunakan dalam PCR, maupun dalm mengetahui proses dalam melakukan PCR.
1.3 Waktu Dan Tanggal Praktikum
Waktu Praktikum : 09:00 PM
Tanggal Praktikum : 11/12/2013
Tempat Praktikum : Laboraturium
Mikrobiologi Dan Bioteknologi Fakultas Peternakan Unuversitas Mataram
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Elektroforesis merupakan
proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu
medan listrik. Kecepatan molekul yang
bergerak pada medan listrik tergantung pada
muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan
asam nukleat).Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi
dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan
kuantifikasi dengan densitometer.Elektroforesis untuk
makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas
dari arus listrik yang digunakan.Elektroforesis
biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat
bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media
penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan
dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam
elektroforesis antara lain yaitu kertas,
selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid
dan agarosa merupakan matriks penyangga
yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.
Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein
yakni: (Soedarmadji, 1996)
1. Ukuran molekul protein
Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.
2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.
2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium
pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion
sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer
akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi
maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan
molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga
aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.
4. Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang
bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai
daya serap yang baik,
sebagai migrasi elektron atau penyaringan
berdasarkan ukuran molekulseperti gel poliakrilamid (Pratiwi, 2001).
5. Kekuatan voltase
1.
Jika ukuran pori dari medium kira-kira
sama dengan molekul, maka molekul yang
lebih kecil akan berpindah lebih bebas
di dalam medan listrik, sedangkan molekul
yang lebih besar akan dibatasi dalam
migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur
dengan mengubah konsentrasi penyusun gel
poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid
2.
Voltase yang dipakai rendah (100-500) V,
kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang
digunakan.
3.
Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara
lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah
serta jenis arus yang dipakai selalu
harus searah (bukan bolak balik).
6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung.
Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses
bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur
rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.Pada saat elektroforesis
berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda
positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat
molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh
pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein
dengan berat molekul lebih besar akan bergerak
pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya
rendah (Sumitro, 1996).
Hasil elektroforesis
akan didapatkan pita-pita protein yang
terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal
tipisnya pita yang terbentuk dari pita
protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein
yang mempunyai berat molekul yang sama yang
berada pada posisi pita yang sama. Hal ini
sejalan dengan prinsippergerakan molekul bermuatan,
yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di
bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama
akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji,
1996).
BAB III
MATERI DAN
METODE PRAKTIKUM
3.1 Materi Praktikum
3.1.1 Alat dan Bahan Praktikum.
Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :
1.
Mesin PCR
2.
Elektroforesis
3.
Transiluminator sinar UV
4.
Mikro pipet
5.
Tabung ependorf
6.
Gloves (sarung tangan)
3.1.2 Bahan Praktikum
Adapun bahan
- bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :
1.
Air steril
: 6,7 µl
2.
10 x buffer TAQ
: 10 µl
3.
2,5 Mm dNTP mix :
10 µl
4.
10 µM primer foward : 10 µl
5.
10 µM primer reverse : 10 µl
6.
Template
: 10 µl
7.
Enzim
: 5 µl
3.2 Metode Praktikum
Adapun
metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :
1.
Mengambil air steril sebanyak 6,7 µl dan
dimasukkan dalam tabung PCR
2.
Menambahkan 10 x buffre TAQ dan dimasukkan dalam
tabung PCR
3.
Menambahkan 2,5 mM dNTP mix sebanyak 0,4 µl
4.
Menambahkan 10 µM primer forward sebanyak 0,4 µl
5.
Menambahkan 10 µM primer reverse sebanyak 0,4 µl
6.
Menambahkan template 1 µl
7.
Menambahkan enzim polimerase sebanyak 0,1 µl
8.
Setelah itu di mix supaya homogen dan dimasukkan dalam
mesin PCR yang sebelumnya sudah diatur programnya.
9.
Hasil PCR tadi dimasukkan dalam elektroforesis
10. Menambahkan
looding late supaya kelihatan, dan dimasukkan pada masing-masing lubang gel 1 –
4, tunggu selama 10 menitKemudian diamati di transimlator sinar UV.
BAB IV
HASIL DAN
PEMBAHASAN
4.1 Hasil Praktikum :
Hasil praktikum yang didapatkan dari PCR lubang gel 1-4 terdapat 2 lubang yaitu
positif dan negatif. Seperti yang terlihat pada gambar dibawah ini.
Gambar 1. Hasil digesti DNA plasmid mengunakan beberapa enzim restriksi
4.2
Pembahasan
Reaksi PCR mulai menghasilkan salinan urutan target secara eksponensial.
Hanya selama fase eksponensial dari reaksi PCR adalah mungkin untuk
ekstrapolasi kembali untuk menentukan kuantitas awal dari urutan target yang
terkandung dalam sampel. Karena inhibitor dari reaksi polimerase ditemukan
dalam sampel, keterbatasan reagen, akumulasi molekul pirofosfat, dan self-anil
dari produk mengumpulkan, reaksi PCR akhirnya berhenti untuk memperkuat urutan
target pada tingkat eksponensial dan "dataran tinggi efek" terjadi,
membuat titik akhir kuantifikasi produk PCR dapat diandalkan. Ini adalah
atribut yang membuat PCR Real-Time RT-PCR kuantitatif sangat diperlukan.
DNA template
- sampel DNA yang berisi urutan target. Pada awal reaksi, suhu tinggi
diterapkan untuk molekul DNA beruntai ganda yang asli untuk memisahkan alur
dari satu sama lain.
DNA polimerase - jenis enzim yang mensintesis untai DNA komplementer baru ke
urutan target. Yang pertama dan paling umum digunakan adalah enzim-enzim Taq
DNA polimerase (dari aquaticus Thermis), sedangkan PFU DNA polimerase (dari
Pyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena kesetiaan yang lebih tinggi
saat menyalin DNA. Meskipun enzim ini agak berbeda, mereka berdua memiliki dua
kemampuan yang membuat mereka cocok untuk PCR: Mereka dapat menghasilkan untai
DNA baru menggunakan template DNA dan primer,Mereka tahan terhadap panas Primer
- potongan pendek DNA beruntai tunggal yang melengkapi urutan target.
Polimerase dimulai sintesis DNA baru dari ujung primer.
Nukleotida (dNTP atau trifosfat
deoksinukleotida) - unit tunggal dari basa A, T, G, dan C, yang pada dasarnya
"blok bangunan" untuk untai DNA baru. RT-PCR (PCR Transkripsi
Reverse) yang didahului dengan konversi PCR RNA sampel ke cDNA dengan enzim
reverse transcriptase.
Ada beberapa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR, antara lain
sebagai berikut :
1.
Pada saat pengambila gel salah
2.
Pengambilan frimer ataupun reverse tertukar
3.
Enzim
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Elektroforesis merupakan
proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu
medan listrik. Kecepatan molekul yang
bergerak pada medan listrik tergantung pada
muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan
asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi
dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan
kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk
makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya
panas dari arus listrik yang digunakan. Gel
poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks
penyangga yang banyak dipakai untuk separasi
protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang
dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida
(PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) untuk
separasi sampel protein. Banyak molekul biologi
bermuatan listrik yang besarnya tergantung
pada pH dan komposisi medium dimana molekul
biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam
suatu medan listrik, molekul biologi yang
bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda
negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang
dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul
berdasarkan muatannya.
Cara kerja menggunakan metode
elktroforesis adalah:
1) Ektraksi enzim
2) Pembuatan gel
3) Penempatan sampel
4) Proses Elektroforesis
5) Visualisasi sistem enzim
6) Metode Analisis.
5.2
Saran
Saran pada praaktikum kali ini
adalah sebaiknya praktikum dilakukan oleh praktikan sendiri
dan dilkukan proses elektroforesis yang
sebenarnya supaya praktikan lebih mengetahi cara menggunakan metode
elektroforesis
DAFTAR PUSTAKA
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1.
Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta
Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama.Liberty.
Yogyakarta.
Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus
Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Brawijaya. Malang
LAMPIRAN
Komentar
Posting Komentar